实验九、畜禽原虫病

    一．内容：

    1．伊氏锥虫形态观察及实验室诊断。

    2．牛双芽巴贝斯虫、牛巴贝斯虫、牛泰勒虫形态观察。

    3．弓形体形态观察。

    4．鸡、兔球虫形态观察。

    5．住肉抱子虫形态观察。

二．目的：通过上述虫体观察，能够鉴别其主要形态特征并掌握伊氏锥虫的常规诊断法。

    三．参考资料：

    1．伊氏锥虫Trypanosoma evansi在分类学上属于鞭毛虫纲Mastigophora锥虫科Trypanosomatidae属Trypanosoma。

    宿主与寄生部位：寄生于马、驴、骡、牛、水牛、骆驼和犬等家畜的血浆内。

    形态特征：伊氏锥虫为单形锥虫。长18~34微米，宽1~2微米，平均为24×2微米，前端比后端尖；波动膜发达，宽而多皱曲，游离鞭毛长6微米，细胞核（主核）位于虫体中央，呈椭圆形，动基体距虫体后端约1.5微米，呈圆形或短杆形，胞浆内含有少量的空泡；核的染色质颗粒多在核的前部。在压滴血液标本中，原地运动时相当活泼，而前进运动时比较迟缓，在姬氏染色的血片中，核与动基体呈深红紫色，鞭毛呈红色，波动膜呈粉红色，原生质呈淡天兰色。

    传播者：虻、螫蝇及虱蝇是其主要传播者。

    伊氏锥虫病实验室诊断：

    （１）全血压滴标本检查法

    在洁净的载玻片上滴病畜血液一小滴，与放在载玻片上的一滴生理盐水混合后，覆以盖玻片，用400~~600倍高倍镜观察，如有锥虫，多在血细胞间活泼地运动。但每次镜检必须观察100~200个视野以上。冬季室温过低时，锥虫活动力减弱不易观察到，这时可将玻片放在酒精灯上稍稍加温，以增强锥虫的活动力。此外，在血液干涸后检查，锥虫往往死亡，影响检查结果。此法在血内虫体较少时，往往不易被发现。

（２）血涂片染色标本检查法

从耳静脉采血，至少作二张以上涂片，染色后镜检有无虫体用姬姆萨染色后，虫体原生质染成淡兰色，细胞核和鞭毛染成淡红紫色。本法于病初体温升高时，采血作涂片，容易得到阳性结果。

    （３）血液厚滴涂片标本检查法

    取血一大滴放在载玻片中央处，用另一玻片角将血液堆成直径约1厘米的涂面，在空气中自然干燥，然后用冰醋酸１毫升，加蒸馏水100毫升配成的液体处理数分钟将红细胞全部溶解后，再使涂片干燥。以甲醇固定后，再用姬萨染色镜检，此法比涂片染色标本容易找到虫体。

    （４）集虫检查法

    自颈静脉采血约５毫升，盛在预先装有枸橼酸钠（每毫升血约用５毫克）的沉淀管内，混合后，以1500转/分速度，离心沉淀3~5分钟，此时红细胞沉淀于管底，白细胞在红细胞上面。由于虫体比重与白细胞相近，故虫体集中于白细胞层中。用吸管取白细胞层的材料作成压滴标本检查，可以提高虫体的检出率。在没有离心机的情况下，可在5~10毫升的试管中预先放入２％枸橼酸钠生理盐水2~5毫升，从颈静脉采血2~5毫升，轻轻摇匀，放置在试管架上，自然沉淀2~3小时，用吸管吸取红细胞层表面物少量，滴一小滴于载玻片上，作成压滴标本镜检，每头牛作2~4个压滴标本，每个压滴标本应观察100个以上的视野。

    （５） 活锥虫集结试验（团集反应）

    用人工感染小白鼠血中活锥虫血一滴置于载玻片上，再加入一滴被检查的牛清后，如此家畜患有锥虫病则显微镜下可看到虫体就以后端相靠拢，有鞭毛的一端向外集结菊花瓣状。如被检牛未受锥虫感染则虫体不集结。

    （６）动物接种试验

    在上述各种方法尚不能确诊时，可取可疑动物的血液，接种于实验动物（小白鼠0.2~1.0毫升）的皮下或腹腔内，接种后第三天开始用压滴法检查尾血中是否有锥虫出现，至少要持续检查一个月。如一个月后未发现虫体，可以不再检查，判为阴性。此法检出率较高。

    （７）间接血疑试验

    ①致敏血球悬液的制造：

    Ａ、锥虫抗原的制备：用小白鼠从疫区采回虫种，分别保种于海猪备用，用时再取海猪心血接种于小白鼠，待见虫后用任两株的混合虫株接种于大白鼠或预先摘除脾脏的犬，经过四、五天发病后将其放血于抗凝生理盐水之后，并用生理盐水多次离心（3000转/分，20分钟）洗涤将纯白虫体，然后按虫体压积加pＨ7.2磷酸缓冲盐水（PBS）作10倍稀释。放低温（－25℃左右）保存备用。当用其致敏血球时，取出在低温条件下反复冻融数次。离心取上清液即为抗原，余下的虫渣可用玛瑙研钵研磨两小时后再冻融，离心取上清液并入上述抗原中，再按原虫体积计，加入pＨ7.2PBS中将其稀释到１/500的浓度，即可用于致敏。

    Ｂ、致敏血球的制备，步骤如下：

    ａ、采取2~5岁健康公绵羊脱纤血若干，用生理盐水将其稀释20倍，2000转/分离心15分钟去上清液，再用生理盐水反复离心洗三次，然后按血球压积计，用pH7.2PBS配成5％血球悬液。

    ｂ、等量加入含２％丙酮醛的PBS于5％的血球悬液中，摇匀，置室温30分钟后。再置普通冰箱内醛化固定17小时，经常摇动。然后用2000转/分离心10分钟去上清液（可收回反复再几次，用时则直接将血球压积稀释成2.5％的悬液即成）用PBS离心洗三次，再用PBS配成５％的血球悬液。

    ｃ、等量加入１/２万的鞣酸生理盐水溶液于上述醛化过的５％的血球悬液中，摇匀，置37℃的水浴鞣化30分钟，同法离心去上清再用PBS离心洗三次，再配成５％的血球悬液。

    ｄ、等量加入含２％戊二醛的PBS于上述鞣化过的血球悬液中，摇匀，置室温醛化两小时，同法离心去上清液（可回收反复用用，方法同丙酮醛），再用PBS离心洗三次。

    ｅ、用上述新配的1/500抗原液直接稀释血球压积成50％血球悬液，放37℃水中热致敏40分钟，或放4℃冷致敏7天，最后离心去上清液和用PBS离心洗三次，再用含0.5~1％健康兔血清PBS配成２％的血球悬液，并按0.1％计，加叠氮钠防腐，即成致敏血球悬液。同时同法，做一批不加抗原的非致敏血球悬液，作对照用。

    ②、凝集试验及其结果的判定

用Ｖ型或Ｕ型微量血凝板，将被检血清用pＨ7.2PBS作倍比稀释。每孔0.025~0.05毫升，同法做两排。一排加致敏血球悬液为测定排，另一排加非致敏血球悬液作对照排。每孔滴一滴（人用４号针头，约0.007毫升），同时两排后边再设1~2孔仅加稀释液PBS与血球悬液的空白对照，摇匀放室温（25~30℃）1~2小时。待空白对照孔血球全部淀于孔底，边沿呈光滑圆点状时，即可判定结果，测定排各孔的血球呈均匀薄层平铺于孔底似毛玻璃状，或其边沿有不规则的皱缩。又或血球凝集成一小圆圈状，或其边沿有小颗粒血球凝块等。均可判为阳性反应。否则如空白对照孔为阴性反应，对照排可能也有非特异性凝集， 但其凝集的最高倍数要比测定排低两个滴度以上。 并且测定排凝集价要在80度以上才能判定被检血清为阳性。

    2．牛双芽巴贝斯虫属于孢子虫纲Sporozoa，血孢子虫目Haemosporidia，巴贝斯虫科Babesiidae 的巴斯属Babesia，牛泰勒虫属于泰勒科Theieeriidae泰勒属Theileria。

    （１）牛双芽巴贝斯虫 B.bigemina

    宿主及寄生部位：寄生于黄牛、水牛的红细胞内。

    形态特征：是一种大型虫体，其长度大于红细胞半径。有环形、椭圆形、梨形（单个或成对）和变形虫形等不同形状的虫体，在进行出芽生殖过程中，还可以见到三叶形的虫体。特征性虫体是两个梨籽形虫体以尖端相连构成锐角，其长度大于红细胞半径，绝大多数位于红细胞的中央。一个红细胞内多为1~2个虫体，姬姆萨染色后，原生质呈淡兰色，边缘较深，中央部分淡染或不着色，呈空泡状的无色区，染色质多为两团，位于虫体边缘部。环形虫体的直径为1.4~3.2微米，单梨形虫体长2.8~6微米。

    传播者：微小牛蜱B.microplus。

    （２）牛巴贝斯虫B.bovis

    宿主及寄生部位：牛的红细胞内，属小型虫体。

    形态特征：形态有环状、椭圆形、单个或成双的梨形、边虫形和阿米巴形等，在繁殖过程中出现三叶形的虫体。特征性虫体是以两个梨形虫体以尖端相连构成钝角，多位于红细胞的边缘，少数位于中央。梨形虫体的长度小于红细胞半径。具有一团染色质。病的初期以环形和边虫形为多，以后出现梨形虫体。

    传播者：蓖子硬蜱和全沟硬蜱 I.persulcatus。

    （３）牛泰勒虫  多数指的是环形泰勒虫T.annulata

    宿主及寄生部位：宿生在牛的网状内皮细胞和红细胞内。

    形态特征：形态多样化，环形虫体呈戒指状，最为常见，染色质一团，居虫体一侧边缘上，姬氏法染色后，原生质呈淡兰色，染色质呈红色。大小为0.8~1.7微米，椭圆形虫体比环形者略长略大，其长宽比例为1.5:1，两端钝圆，大小为1.5~2.1×0.7微米。杆状虫体一端较粗，一端细，弯曲或不弯曲，染色质团在粗端，形似钉子或大头针，长约1.0~2.0微米。圆点状或边虫状虫体没有明显的原生质，由染色质组成，大小为0.7~0.8微米，十字形虫体不常见，由４个圆点状虫体组成，原生质不明显，大小为1.6微米，一个红细胞内的虫体数可以有1~12个不等，常见的1~3个，各种形态的虫体可同时出现于一个红细胞内。另外寄生在网状内皮系统的虫体称石榴体（或称柯赫氏兰体），存在于淋巴细胞的单核细胞内，也可游离于淋巴液中，偶见于血浆中，大小为2.2~27.5微米，姬氏染色后，在浅兰色的原浆里包含有数目不等的微红色或暗紫色的染色质，石榴体为虫体的裂殖体阶段，它在形态上有多种类型，一种为大裂殖体，体内含有直径0.4~1.9微米的染色质颗粒，并产生直径为2~2.5微米的大裂殖子，另一种为小裂殖体，它含有直径为0.3~0.8微米的染色质颗粒，并产生直径为0.7~1.0微米的小裂殖子。

传播者：璃眼蜱属的各种蜱。

    3．刚第弓形体Toxoplasma gondii  又称刚第弓浆虫，目前认为弓形体只有这一种。

    宿主与寄生部位：弓形体的宿主范围很广，包括人、狒狒、黑猩猩、箭猪、小白鼠、骆驼、兔、松鼠、地鼠、野兔、狸、犬、猫、狐狸、水貂、羊、猪、牛、鸽、鸡、青雷鸟等几十种之多，为细胞内寄生。

    形态特征：根据其发育阶段不同分为五型，即滋养体、包囊出现在中间宿主——猪等体内。卵囊、裂殖体、配子体出现在终末宿主——猫体内。

    滋养体  呈新月形、香焦形或弓形，大小为4~7×2~4微米，一端稍尖，一端钝圆。姬氏染色后，胞浆呈浅兰色，有颗粒，核呈深兰紫色，偏于钝圆一端。

    包囊  呈圆形或椭圆形，有较厚的囊膜，囊中的滋养体可多达50个左右，包囊的直径可达50~60微米。

    4．家畜球虫病原体是孢子虫纲球虫目虫艾美耳科的原虫，均系细胞内寄生。各种家畜都有其专性寄生的球虫，而不互相感染。在兽医上重要的有两个属，即艾美耳属和等孢属。

    艾美耳属Eimeria：特点是卵囊内的胚孢子形成四个孢子囊，每个孢囊内含两个子孢子。广泛寄生于各种家畜。

    等孢属Isospora：特点是卵囊内胚孢子形成四个孢子囊，每个孢子囊内含四个子孢子。通常寄生于人、犬及其它肉食动物。

    寄生于鸡、兔体内的球虫属于艾美尔属。

    卵囊：在椭圆形、圆形、卵圆形等不同形状。囊壁有二层，外层为保护性膜，结实，有较大的弹性，内层为小颗粒层，卵囊内原生质呈颗粒状。有些种类的卵囊有明显的卵膜孔，有些卵囊内膜突出于卵膜孔外形成极帽。

    5．住肉孢子虫：属于孢子虫纲，住肉孢子虫属Sarcocystis，为多种家畜的寄生虫，偶

尔也寄生于人。常见的有：

    羊住肉孢子虫S.tenella  为较大的一种，呈卵圆形或椭圆形，长１厘米。主要寄生于绵羊、山羊和猪的食道、膈肌和心肌。

    牛住肉孢子虫S.fusiformis  长１厘米或更大些，主要寄生在牛的横纹肌、心肌和食道。

    马住肉孢子虫S.bertrami  呈乳白色线状，长0.6~1厘米。寄生于马、驴、骡的心肌和横纹肌。

    各种住肉孢子虫在形态构造上均大致相同，通常见到的虫体是寄生在肌肉组织间的，与肌纤维平行的包囊状物（孢子囊），多呈纺锤形、卵圆形或圆柱形等形状，色灰白至乳白，小的肉眼难以看到，大的可以长达１厘米至数厘米。

    孢子囊又“米休尔氏囊”。长0.5~4厘米，宽可达3毫米。囊壁由两层组成，内壁向囊内延伸，构成很多中隔，将囊腔分成若干小室。发育成熟的孢子囊，小室中包藏有许多肾形、镰刀形或香蕉形的滋养体（又称南雷小体 Raineys corpuscle），长约10~12微米，宽4~9微米，一端稍尖，一端钝圆，核偏于钝圆一端，胞浆中有许多异染颗粒。

四．作业：

    1．绘伊氏锥虫形态图，并标明其结构特征。

2．绘双芽巴贝斯虫及巴贝斯虫寄生形态图，并简要说出其鉴别特征。

3．绘出艾美尔属球虫卵囊的模式图。