第九章 实验室检验概述

第九章  实验室检验概述

实验室检验——是采取畜禽的血液、尿液、粪便或其他体液(如胃液、脑脊液、胸腹腔穿刺液等)及病理产物(如肝、脾、淋巴结、骨、肌肉等),在实验室特定的设备与条件下,测定其物理性状、分析其化学成分,或借助于显微镜而观察其有形成分的方法。实验室检验对许多疾病的确定诊断、判断预后和观察疗效等都具有重要意义。可以说,没有实验室检验的诊断结果,往往是不够完善的。因此,实验室检验已成为兽医临床上不可忽视的工作。实验室检验应注意的几个问题:

送往实验室的材料,应该随时附上病史、临床病案报告、任何尸体剖检的结果以及请求需要检查的种类和范围。材料收集以后应迅速发送。同时必须根据国家要求,仔细做好材料的包装和标签工作。

要复习有关基础课程(如化学、生理、病理和生化等);

要了解各项化验的原理、方法、注意事项和化验标本的采集方法等。

建立诊断时,要结合病史和临床资料综合分析化验结果。

正确解释检验结果的临床意义,不应盲目地套用人医的结论,而应根据兽医的特点加以解释。

选择检验项目要有针对性;

严格遵守操作规程,防止发生实验事故。

第一节 血液标本的采取和抗凝剂

一、血液标本的采取

根据检查目的或需血量的不同,血液标本可取自末梢血或静脉血。

1、末梢采血   适用于需血量少而且采血后立即进行稀释的项目。如制作血片、血红蛋白测定、各种血细胞计数、出血和凝血时间测定等,大动物可在耳尖部剪毛、并用酒精棉球消毒,待酒精干燥后,以1618号针头刺入1厘米左右,血液即可流出。擦去第一滴血(因其混有组织液),取第二滴血检查。中小动物可穿刺耳边缘的小静脉。

2、静脉采血   凡需血量较多,或需要血浆,或在现场不便检查的项目,均应静脉采血。

1)马、牛、羊的采血,可利用颈静脉,犬可利用臂或小隐静脉(后肢),奶牛还可利用乳静脉或尾中静脉。乳静脉采血时,要用细些的针头,以防止发生血肿。尾中静脉采血时,较容易保定,只需将尾部尽量高抬,枕头在第23尾椎间,由下向上垂直刺入约1厘米,然后缓慢向下拔出,直至血液流出。

猪的采血,大猪可利用耳静脉,中小猪可用前腔静脉采血,方法如下:

保定:将猪仰卧或右侧卧,把两前指向后上方拉直,同时将头向下压,使头颈伸展。这样可使前腔静脉紧张并可使胸前窝充分暴露出来(也可取站立保定,见基础”195页)。

部位:在左侧(右侧亦可)胸前窝,即由胸骨柄、胸头肌和胸骨舌骨肌的起始部构成的陷窝内。

方法:在玻璃注射器内事先吸入适量的抗凝剂(制备血清则否),右手持针管,使针头与地面垂直,或斜向后上方与地面呈60度角,刺入2—3cm即可抽出血液。术前术后均按常规消毒。

3)鸡的采血   可利用翼下静脉或心脏穿刺采血。翼下静脉采血时,可用小针头刺入静脉,任其自由流入装有抗凝剂(制血清不加抗凝剂)的小瓶内,不可用注射器抽取,因其容易引起静脉塌陷和出现气泡。心脏穿刺采血时,将鸡右侧卧(或仰卧)保定,左胸部向上(或胸前窝向上),用注射器接上16号针头,在胸骨脊前端与背部下凹处连线的中点,垂直或稍向前(后)内方刺入2—3cm,可采得心血。鸡的静脉采血时应注意:

针头要干燥、洁净,以防发生溶血。

在将血液注入容器时,要拔去针头,沿管壁缓缓注入。

注射器用完后立即清洗,以防血液凝固在注射器内。

4)鹅、鸭的采血  可利用枕静脉窦穿刺采血。其部位在枕骨后缘和第一颈椎骨前缘正中位置(绘枕静脉窦位置图)。操作时,令助手保定鹅、鸭体呈腹卧或侧卧(左右均可)式,术者于助手左侧(或右侧),用左手握住鹅(鸭)的喙部(不能堵塞鼻孔)以固定头部,使鹅头背侧朝向外侧方;右手持针头(12—20号)刺入0.5—1.5 cm,即见血流出。用于制备血清的成鹅,一次采血150ml左右,每周一次;成鸭一次可采60ml左右,每周一次。

5)血清的制备方法

由静脉采血,不加抗凝剂,任其自然凝固,析出血清。

牛羊的血样应立即离心沉淀。如无离心设备,则应将盛血容器斜放,使血液凝固形成斜面,以析出足量的血清。

在冬天,血块收缩缓慢,应将血液置于装有25—37℃温水浴中,促使血清快速析出。

二、抗凝剂

1EDTA(乙二胺四乙酸二钠)  其优点很多,主要是对血细胞的形态影响不大,可防止血小板聚集,在室温下数小时,对血红蛋白、血小板、血片染色均无不良影响。如在冰箱内保存,24小时内,对细胞压积容量和血红蛋白测定,以及红、白细胞计数均无影响。EDTA的抗凝机理是夺取血液中的游离Ca2,形成EDTACa螯合物。其用量一般为1—2  mg/ml血液,超过2mg时,可使细胞皱缩;也可配成10%的水溶液,每2滴可使5ml血液不凝固。

2、草酸盐(NaKNH4等)   其抗凝作用是夺取血中游离的Ca2+,以形成不溶解的草酸钙。草酸钾的溶解度大,抗凝作用强,可使红细胞皱缩;草酸铵则使红细胞膨胀,两者按一定比例混合,可使红细胞大小不变,适用于细胞压积容量的测定。其配方是:草酸钾0.8g,草酸铵1.2g,馏水100ml。取此液0.5ml,(在40—60℃的烘箱中烘干备用)可使5ml血液不凝固。

3、柠檬酸钠   又名枸橼酸钠,其抗凝机理是与血中游离Ca2+松散地结合为柠檬酸钙复合物。常用于血沉测定及输血时的抗凝剂,不适用于血液的化学检验。配成3.8%的水溶液,此液0.5ml可使5ml血液不凝固。

4、肝素   肝素可阻止凝血酶原转变成凝血酶而起抗凝血酶的作用,其优点是抗凝作用强,不影响红细胞的大小,对血液化学分析干扰小,多用于科研工作。但缺点是价格昂贵,且不宜作纤维蛋白原的测定和细胞形态学研究(血片染色后呈淡兰色背景,使细胞轮廓浓染而不清晰)。常用1%肝素钠水溶液,此液0.1ml可使5ml血液不凝固。

血液采集后最好尽快处理,除作凝固试验以外的其他检验,可允许放置若干小时。必要时可暂时放冰箱保存。

三、血液标本变异因素的控制方法

静脉采血后,血液虽离开血管,但血细胞的代谢活动并未终止,血液接触空气后,气体含量也发生改变,结果引起细胞内外一系列成分的变动。因此,必须对其变异因素进行控制,以免影响检验结果的正确性。其控制方法如下:

(一)空腹采血   血液中化学成分可受饮食、药物及离体后物理化学因素的影响。因此,首先应在病畜基础代谢状态采取标本。即早晨空腹或禁食6小时后采取血液,其分析结果才具有较真实的代表性。在进食后采取的标本,往往出现血糖、甘油三酯和麝香草酚浊度增加,血清无机磷降低。

(二)防止气体逸散   血液暴露于空气中后,CO2迅速逸出,并吸收O2而提高血O2饱和度,进而引起血液PH及其他血浆成分的某些改变,因此在测定血液PH及气体时,要求以密闭手续采血。

(三)防止分解   血样要尽快分析,以减少分解的影响,必要时可加保存剂(如用氟化钠作测血糖血液的保存剂)以防止分解。有些检测项目(如丙酮酸、无机盐等)可于半小时内做成血滤液,以防分解。

(四)防止污染   采血器具及标本容器都必须化学清洁,尤其是测定蛋白结合碘、血氨及血清中微量元素如CuFe等,均须经化学处理并用重蒸馏水冲洗过的器材,不能用普通注射器和标本容器,以防污染而影响结果。

(五)防止溶血   溶血可影响理化检验结果。例如,谷草转氨酶(GOT)、乳酸脱氢酶(LDH)、酸性磷酸酶(ACP)及钾等,红细胞中的含量超过血浆10多倍乃至100多倍。溶血后,血清中这些成分就会显著增高。且溢出的Hb可直接抑制脂肪酶等活性,影响胆红素的重氮反应,或由于其颜色而干扰比色测定。

起溶血的原因

注射器或试管潮湿;

抽血后未卸下针头而将血液强力注入试管中;

用强力摇动血液或剥动血块;

离心速度过高;

冷藏温度过低;

抗凝剂使用不当;

采血时压迫静脉过久等。

2、防止溶血的方法

注射器、试管必须干燥洁净,采血后卸下针头再将血液沿管壁徐徐注入试管内,若为抗凝血,应请轻轻倒转试管与抗凝剂混和,切忌用力振摇。

防止过多过早剥动血块,寒冷使红细胞脆性增大,应将血液放于37℃温水浴中预温半小时后,再用竹签将血块从管壁剥离,并继续保温,促使血清析出。

如不能很快检验,血液应放于4℃保存。

(六)标本来源一致

采血部位一致;

动物的状态一致(如均于饥饿时采),即时间大致相同。

作比较研究时,被采血动物的种类、性别、年龄(日龄)等均须一致。1. 贫血。红血球数和血红蛋白含量减少;血红蛋白减少症;异形红血球症;红血球大小不均症;嗜多色性红细胞。

2.哺乳动物白血病。(a)淋巴性白血病。主要发生于犬和牛。淋巴细胞数量大大增加,数量大大增加。曾证实每立方毫米血液中的白血球数量在犬为624000,而在牛为159000。红血球数量减少,有时少于2000000,而在红血球外观上,具有相关的贫血变化。(b)骨髓性白血病:很少发生。多形核白细胞数量增加,且以嗜中性白细胞为主;呈嗜中性白血球前身的外观。白血球总数虽然较正常为多,但每立方毫米血液中很少超过50000。红血球数量减少,且通常伴同贫血而有血象变化。

(c)假性白血病。虽然具有臭性白血病的临床病症(淋巴或骨髓组织增生,贫血),但白血球数量正常。

3. 化脓性疾病。白细胞增多,特别是嗜中性白细胞。通常伴有左移现象

4.肠道寄生虫。伴同贫血而有血象变化。嗜酸性白细胞增多,在旋毛虫病特别显著。

5.焦虫病。伴同贫血而有血象变化。焦虫很小,呈梨状或哑铃状的结构,位于红血球内的中央或边围,并染成蓝色和红色。应小心观察,勿以污屑或染料沉着物而误认为是这些虫体。

6.牛创伤性网胃-心包炎。血液对于区别诊断和预防有价值。若病例尚处于网胃炎时,仅有轻度的白血球增多症(每立方毫米达于12ooo)和明显的、相对的嗜中性白血球增多症(嗜中性白血球占5060%),且伴有显著左移现象。嗜酸性白血球由正常水平的10%减少至3%或更少。这种血象暗示所谓防御期

另一方面,在创伤性心包炎时,有很明显的白血球增多症(每立方毫米达于30000)。嗜中性白血球增多症异常显著(70%80%),且伴有更严重的左移现象。嗜酸性白血球数量更成少,甚至没有。这种血象表明为侵入期

7.母犬封闭性子宫积脓。血象在诊断上价值很大。具有明显的伴有左移现象的白血球增多症。嗜酸性白细胞减少,并嗜碱性白细胞体积增大。同时,红细胞沉降速率增加。

第二节 尿液的采集和保存

采集尿液,通常用清洁的容器,在家畜排尿时直接接取。也可用塑料或胶皮制作接尿袋,固定在公畜的阴筒下方或母畜的外阴部以接取尿液。必要时进行人工导尿。若作细菌学检查,尿液收集必须遵照灭菌预防程序。

需收集24小时尿液的,一般于清晨6时始至次晨6时止,测其总体积,认真记录后混和,取出约200ml,从速送检。

尿液采集后应立即检查。如不能及时检查或需送检时,为了防止尿液发酵分解,须加入适量的防腐剂。常用的防腐剂及其用量如下:

(一)甲苯   100ml尿加入0.5—1.0ml,使其在尿液表面形成薄膜,可防止细菌发育。检验时吸取下层尿液。

(二)硼酸   0.25g/100ml尿加入。

(三)樟脑   加入微量。

(四)甲醛溶液   100ml加入3—4滴,因甲醛能凝固蛋白质,故可抑制细菌生长。用甲醛作防腐剂的尿液,不适宜作蛋白质和糖的检查。

(五)麝香草酚   100ml加入0.1g,可制止细菌生长,但蛋白质试验易出现假阳性反应。

(六)氯仿   100ml加入0.5ml,可以防腐,但不适于作蛋白质、血红蛋白及胆红质的检查。

以上前3种防腐剂,对各项实验均无妨碍,可直接使用。但要注意,作细菌学和毒物检验的尿液,不可加入防腐剂。

第三节 粪便的收集与保存

粪便检查,除用于诊断寄生虫病外,还在于了解消化器官的消化功能,有无炎症、出血或其他病理改变,作为临床诊断的参考。

粪便检查,必须收集新鲜而未被尿液等污染的粪便(最好于排粪后立即采取没有接触地面的部分),盛于洁净容器内。必要时,对大家畜可由直肠直接采取,其他家畜可用生理盐水灌肠采粪。

采集粪便,大家畜一般不少于60g,并应从粪便的内外各层采取。

采取的粪便,最好立即送检,如当天不能检验,应放在阴凉处或冰箱内,但不易加防腐剂(消化试验除外,收集2—10%的粪便,按每g鲜粪加10%硫酸20ml,以免氨氮损失)。

第四节 毒物分析采样

通过毒物分析,常能确定中毒的性质。应取可疑的饲料、胃肠内容物、呕吐物、血液、肝、肾、尿液(或完整的膀胱)等送检。采样注意事项:

(一)样品应避免化学污染;

(二)样品不能用水冲洗,以免冲淡或除去残毒及被水污染。

组织样品应放入清洁干燥的玻璃容器中密封。

样品应注明畜主姓名、畜别和畜号、死亡日期、取样时间、送检目的和送检单位(包括联系电话和联系人)等。

样品内不要加防腐剂。除非有特殊原因,应加以说明。

送检材料应稍有多余。一般要求:

活体采样:血清5.0,全血5.0,尿50,食物或呕吐物200g

尸体采样:全血或血清10.0,尿50,肝、肾、体脂肪各100g;脑组织(其中1/2冰冻,1/2用福而马林保存);瘤胃或胃内容物500g

可疑饲料、饮水采样量:饲料1000g(足够饲喂豚鼠或家兔1—2周),水100ml

特殊毒物诊断的采样量按检验部门另行规定。

微生物病料的采取、保存与送检

病料的采取

1、脓汁、鼻液、阴道分泌物、胸水、腹水采取法   一般用灭菌棉棒蘸取后,放入灭菌试管中保存。对未破溃的脓汁和胸水等,可直接用灭菌注射器抽取,放入灭菌试管内。如脓汁粘稠不易吸取,可向脓肿内注入1—2 ml灭菌生理盐水,然后再吸取。也可经外表消毒后切开脓肿直接吸取。

2、流产胎儿采取法   在条件许可时将整个胎儿盛入不漏水的桶内或塑料袋内送检。

3、血液采取法   怀疑为炭疽的尸体,应采取末梢血管的血液,用灭菌刀切断耳静脉或趾动脉,以灭菌棉棒蘸取血液放入灭菌试管中,或直接涂于玻片上,干后送检。采血后局部用碘酊浸润的纱布切实包扎。对尸体通常采取心血,先用烧红的烙铁烧烙或酒精火焰消毒右心房表面,然后用灭菌注射器自烧烙部位刺入右心房抽取心血,放入灭菌空瓶中。为了供血清学诊断而采血时,可由静脉采血5—10ml,沿试管壁流入管内,以免产生气泡。

4、实质脏器采取法   应在解剖尸体时立即采取。采取的部位通常是病变部连同一部分正常组织。大小以1.5×1.5cm为宜。当临床上怀疑为炭疽时,应局部解剖用镊子夹出脾脏,剪取一小块,切口用升汞纱布堵塞,脾脏放灭菌瓶中密封包扎后送检。

5、脑组织采取法   按解剖方法将全脑取出,纵切两半,一半放入盛有10%甲醛溶液瓶内,供病理组织学检查;一半放入盛有灭菌地50%甘油生理盐水瓶内,供微生物学检查。

6、长骨采取法   采取完整的掌骨(跖骨)或前臂骨(胫骨)一根,剔去筋腱,用消毒纱布包裹后,装在塑料袋内。

7、肠管采取法   采取外观有病变的肠管一小段,两端结扎,在结扎线外端剪断,放入塑料袋送检。

病料的保存

1、液体病料保存法   供微生物检查的液体病料,放入灭菌试管或小瓶内;供血清学检查的血清装入灭菌小瓶(青、链霉素瓶)内,然后放入装有冰块的保温瓶内保存送检。

2、实质脏器病料保存法   在短时间内(夏季不超过20小时,冬季不超过2天)能送到检验单位的病料,可把装有病料的容器,直接放入事先盛有冰块的保温瓶内送检。短时间内不能送到的病料,必须用化学药品保存。供细菌学检查的病料,放入灭菌液状石蜡或30%甘油生理盐水中保存。供病毒检查的病料放入50%甘油生理盐水中保存;供病理组织学检查的病料放入10%甲醛溶液或95%酒精中保存。病料与保存液的比例为110

病料的送检

供微生物学检验的病料,应放入盛有冰块的保温瓶内及时送。如无冰块,可在保温瓶内放入氯化铵450—500g,加水1500ml,也可使保温瓶内保持0℃24小时。

装病料容器的外面,要用浸消毒液的纱布充分擦拭,瓶口以灭菌棉或胶塞塞紧,并用胶布密封。容器上用贴标签,注明病料名称、采取时间(日期)、保存方法等。

病料要有专人送检,并要避免高温和日光直射,以防腐败和病原体死亡。在送检验病料的同时,附上送检单、病志和尸体剖检记录,以供检验单位参考。

注意事项

当发现突然死亡或死因不明的尸体,须先采取末梢血液或局部解剖采取脾脏,涂片检查,只有确认不是炭疽时,才许可解剖和全面采取病料。

采取病料,应在动物死后立即进行。夏季最多不超过6小时,否则,尸体腐败或因肠道内的细菌侵入内脏而造成污染,影响检验结果。

所用器械、容器都必须消毒灭菌。操作中尽量避免杂菌污染。采完病料后,对解剖场地及尸体要彻底消毒。

严格按无菌操作程序采取病料。

采取病料的种类可根据病情特点和诊断需要灵活掌握。

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