实验八  实验室血常规检验（一）

（红细胞、白细胞计数、红细胞沉降速度、血红蛋白、红细胞压积容量的检验方法）

 

目 的 和 要 求

 

  掌握红细胞及白细胞计数、血沉、血红蛋白、红细胞压积容量的检验操作方法。要求按本书所选用的方法及注意事项进行操作，所得结果应基本正确。

 

内 容 和 方 法

 

（一）红细胞计数

红细胞（RBC）计数方法很多，常用显微镜计数法。

1.原理  血液经稀释后，充入血细胞计数板，用显微镜观察，计数一定容积内的红细胞数并换算成每升血液中的红细胞数。

2.器材与试剂

（1）计数板 计数各种血细胞专用量具。临床上最常用的是改良纽巴氏计算板。它是由一块特制的厚玻璃板构成，通过H形槽沟将其分为上下两个相同计数池。计数池两侧各有1条支柱，将盖玻片盖于计数池的两侧支柱上，盖片与计数池间形成0.1mm高度的缝隙。在各池的平面玻璃上，刻划有9m²面积的刻度，分为9个大方格，每格长、宽各1mm，面积1m²，体积0.1m³，容量0.1μl。四角每一大方格都用单线划分为16个中方格，为计数白细胞之用。中央一个大方格用双线划分为25个中方格，每个中方格又划分为16个小方格，共计400个小方格，此为计数红细胞之用，见图8-1和图8-2。

图8—1 计数池划线图

（2）盖玻片  专用于计数板的盖玻片呈长方形，厚度为0.4～0.7mm。通常大小是24mm×20mm×0.6mm。

（3）沙利氏吸管或选用一次性定量10μl或20μl毛细玻璃管、5ml吸管、中试管。

（4）显微镜、计数器等。

（5）试剂稀释液

①0.85％氯化钠溶液。

②赫姆（Hayem）氏液。

氯化钠（使溶液成为等渗）                                1.0g

结晶硫酸钠（增加溶液的密度，使红细胞不成串钱状）        5.0g

氯化高汞（固定红细胞，并具防腐作用）                    0.5g

蒸馏水                                                  200ml

溶解后加1％伊红溶液1滴，使呈红色，以便识别。

以上两种稀释液，任选一种即可。

图8—2  计数池的正面和侧面

3.操作方法

（1）取小试管1支，加红细胞稀释液3.98ml。

（2）用沙利氏吸血管吸取全血样品至20μl刻度处（或吸血至刻度10μl处，红细胞稀释液用2ml）。

（3）擦去吸管外壁多余的血液，将此血液吹入试管底部，再吸、吹数次，以洗出沙利氏管内黏附的血细胞，然后试管口加塞，颠倒混合数次。

（4）用吸管吸取以稀释好的血液，放于计数池与盖玻片接触处，即可自然流入计数池内。注意充液不可过多或过少，过多则溢出而流入两侧槽内，过少则计数池中形成空气泡，致使无法计数。计数池充液法见图8-3。

图8—3  计数室充液法                     图8—4 红细胞计数顺序

（5）充池后待2～3min，用低倍镜依次计数中央大方格内的四角和正中5个中方格内的红细胞。

计数时，先用低倍镜，光线要稍微暗些，找到计数池的格子后，把中央的大方格置于视野中，然后转用高倍镜，在此中央大方格内选择四角与最中间的5个中方格（或用对角线的方法数5个中方格），每一中方格有16个小方格，所以总共计数80个小方格。计算时要注意压在左边双线上的红细胞应计数在内，压在右边双线上的红细胞则不计数在内；同样，压在上线的计入，压在下线的不计入，此即所谓“数左不数右，数上不数下”的计数法则。计数顺序见图8-4。

4.计算

5个中方格内红细胞数×5×10×200×10⁶＝5个中方格内红细胞数×10¹⁰

式中  5个中方格（即80个小方格）内的红细胞总数

×5 —— 5个中方格换算成1个大方格。

×10 —— 1个大方格容积为0.1μl，划算成1.0μl

×200 —— 血液的稀释倍数。

×10⁶  —— 由微升换算成升。

5.注意事项

（1）红细胞计数是一项细致的工作，稍有粗心大意，就会引起计数不准。为避免计数不准，关键是防凝、防溶、取样正确。防凝是指采取末梢血液的动作要快，防止血液部分凝固。取抗凝血时，抗凝剂的量要合适，不可过少使血液部分呈小块凝集；采血中应及时将血液与抗凝剂混匀。防溶是指防止过分振摇而使红细胞溶解，或是器材用水洗后未用生理盐水冲洗而发生溶血，使计数结果偏低。取样正确是指吸血10μl或20μl一定要准确，吸血管外的血液要擦去，吸血管内的血液要全部洗入稀释液中；稀释液的用量要准；充液量不可过多或过少，过多可使血盖片浮起，过少则计数室中形成小的空气泡，使计数结果偏低甚至无法计数。此外，显微镜台未保持水平，使计数室内的液体流向一侧，这些操作上的错误均可使计数结果不准确。

（2）器械清洗方法  沙利氏吸血管或红细胞稀释管，每次用完后，先用清水吸吹数次，然后在蒸馏水、酒精、乙醚中，按次序分别吸吹数次，干后备下次使用。血细胞计数板用蒸馏水冲洗后，用绒布轻轻擦干即可，切不可用粗布擦拭，也不可用乙醚、酒精等溶剂冲洗。

6.正常参考值

健康动物红细胞数见表8-1。

 

表8—1健康动物红细胞数（万/立方毫米）

 

（二）白细胞计数

白细胞（WBC）计数常用显微镜计数法。

1.原理  用稀释液将红细胞破坏后，混均充入计数池中，在显微镜下计数一定容积中的白细胞数，经换算求得每升血液中的白细胞总数。

2.器材与试剂  与红细胞计数相同。白细胞稀释液可用2％的冰醋酸液，内加1％结晶紫液1滴，以便与红细胞稀释液区别。

3.操作方法

（1）取小试管1支，加入白细胞稀释液0.38ml。

（2）用沙利氏吸血管吸取被检血至20μl处。

（3）擦去管外黏附的血液，吹入小试管中，反复吸取数次，以洗净管内所黏附的白细胞，充入振荡混合。

（4）用毛细吸管吸取被稀释的血液，充入已盖好盖玻片的计数室内，静置2～3min后，待白细胞下沉。

（5）用低倍镜计数四角大格内的白细胞。计数方法和原则与红细胞计数相同。

4.计算

白细胞数/L＝四个大格白细胞数÷4×10×20×10⁶

即：白细胞数/L＝四个大方格内白细胞数×50×10⁶

式中÷4 —— 为每个大格内白细胞平均数。

×10 —— 因一个大方格溶剂为0.1μl，换算为1.0μl。

×20 —— 血液稀释倍数。

×10⁶ —— 将1μl换算为1L。

5.注意事项  与红细胞计数的注意事项同。初学者容易将尘埃异物与白细胞混淆，可用高倍镜观察，白细胞有细胞核的结构，而尘埃异物的形状不规则，无细胞结构。

6.正常参考值  健康动物白细胞数见表8-2。

 

表8—2健康动物白细胞数（个/立方毫米）

动物种类	平均数值	变动范围
马	8000	7000~9000
黄牛、奶牛	7500	7000~8000
水牛	8800	8000~9000
绵羊	8500	8000~9500
山羊	10000	7000~13000
猪	13000	11000~16000
鸡	20000	18000~30000

 

（三）红细胞沉降速度的测定

也称血沉（ESR），是指抗凝血在特制的血沉管中在单位时间内，红细胞下降的毫米数。其方法很多，主要介绍魏氏和涅氏两种方法。

1.原理  红细胞沉降速度与红细胞钱串状的形成、红细胞数目的多少、血浆蛋白的组成以及测定时室温的变化、血沉管倾斜的程度等因素有关。

2.器材与试剂

（1）魏氏血沉管、特制血沉架、涅氏血沉管、采血针头等。

（2）抗凝剂  109mmol/L枸橼酸钠液。

3.操作方法

（1）魏氏法  魏氏血沉管长30cm，内径为2.5mm，管壁有200个刻度，每一刻度之间距离为1mm，附有特制的血沉架见图8-5。测定方法如下：

①取3.8％枸橼酸钠液0.4ml置于小试管中。

②自颈静脉采血1.6ml，加入上述试管，轻轻混合。

③用血沉管吸取抗凝血至刻度0处，用棉花擦去管外血液，直立于血沉架上。

④经15、30、45、60min，分别记录红细胞沉降的刻度数，用分数形式表示（分母代表时间，分子代表沉降mm数）。

  

                      图8—5 魏氏血沉架装置

（2）涅氏法  涅氏血沉管有两种，一种仅有100个刻度，称为“六五”型血沉管；另一种除有100个刻度供测定血沉用之外，一侧自上而下标有20～125，用来表示血红蛋白的百分数，管中央自上而下标有1～13，用来表示红细胞数（百万/mm³），这种管子特称为三用血沉管。二者测定血沉的结果是一致的，故可通用。测定方法是：向涅氏血沉管内加入10％EDTA二钠液4滴或加入草酸钠粉0.02～0.04g。自颈静脉采血，沿管壁接取血液至刻度“0”处，轻轻颠倒混合数次。垂直立于试管架上，经15、30、45、60min，分别读取红细胞沉降的数值。

4.注意事项

（1）血沉管必须垂直静立（牛、羊的血液，血沉速度很慢，可倾斜60°，以加速沉降。注意，其正常值也相应增加）；血液柱面上不应有气泡；抗凝剂的量要按规定加入。

（2）报告结果时，必须注明是用什么方法测定的。

（四）血红蛋白的测定

血红蛋白（Homoglobin，Hb）的测定常用沙利氏（Sahli）比色法。

1.原理  表面活性剂溶解红细胞膜，释放血红蛋白。血红蛋白被高铁氰化钾氧化为高铁血红蛋白（Hi），在一定的PH下，Hi与氰离子（CN^–）结合生成稳定的棕红色氰化高铁血红蛋白（HiCN）。HiCN在波长540nm处有一吸收峰，测定其吸光度，可求得血红蛋白浓度（g/L）。

2.器材与试剂

（1）分光光度计。

（2）试剂HiCN转化液。

氰化钾                                     50mg

高铁氰化钾                                 200mg

无水磷酸二氢钾                             114mg

TritonX－100（或其他非离子表面活性剂）      1.0ml

蒸馏水                                     1000ml

配成后用滤纸过滤，置棕色瓶中，塞紧后保存于冷暗处，但勿使结冰，可保存数月。此液应透明、淡黄色，pH在7.0～7.4之间，以蒸馏水作空白，用540nm比色，吸光度应小于0.001。若变浑、变绿或发生浑浊则应废弃。

3.操作方法

（1）取血液20μl加入5ml血红蛋白转化液中，充分混匀，静置5min。

（2）用分光光度计比色，波长540nm，光径1cm，以转化液或蒸馏水作为空白，测定吸光度（A）。

4.注意事项

（1）可用末梢血液直接测定，静脉血按每毫升血液1.5mgEDTA二钠的比例抗凝，不可用肝素抗凝（可致混浊）。

（2）HiCN法结果准确可靠，操作简便，但试剂中KCN为剧毒，在配制和保存过程中，应提高警惕，防止污染。用于大量标本时，应注意废液处理，可用解毒液解毒，即按每升加次氯酸钠3.5ml混匀后敞开过夜，使CN^–氧化成CO₂和N₂挥发后，在排入下水道。

5.计算

        血红蛋白（g/L）＝测定管吸光度×（64 458÷44 000）×251

                       ＝测定吸光度×367.7

式中   64 458 —— 目前国际公认的血红蛋白平均分子量。

       44 000 —— 1965年国际血液标准化委员会公布的血红蛋白摩尔吸光度。

251 —— 稀释倍数。

6.正常参考值 健康动物血红蛋白参考值见表8-3。

表8—3动物血红蛋白正常值

动物种类	血红蛋白值（克/100ml）
马、骡	11.0（9.0～13.0）
牛	10.0（9.0～11.0）
水牛	8.3（8.0～9.0）
羊	9.8（7.8～11.6）
猪	10.5（9.5～12.0）
鸡	12.5（10.0～14.5）

 

（五）红细胞压积容量（PCV）测定

红细胞压积容量（packed cell volum，PCV）又叫压容和比容，是一种简单、实用的检查方法。

1.原理 在100刻度玻璃管中，充入抗凝血，经一定时间离心后，红细胞下沉并紧压于玻璃管中，读取红细胞柱所占的百分比，即为红细胞压积容量。

2.器材和试剂

（1）温氏（Wiritrobe）管  管长11cm，内径约2.5mm，管壁有100个刻度。一侧自上而下标有0～10，供测定血沉用，另一测标有10～0，供测定比容用见图8-6。如无这种特制的管子，可用有100刻度的小玻璃管代替。

（2）长针头及胶皮乳头  选用长12～15cm的针头，将针尖剪去并磨平，针柄部接以胶皮乳头。也可用细长微细吸管代替。

（3）转速能达4000r/min。

3.操作方法

（1）用长针头吸满抗凝血，插入温氏管底部，轻捏胶皮乳头，自下而上挤入血液至刻度10处。

（2）置离心机中，以3000r/min的速度离心30～45min（牛、羊的血液离心45min），取出观察，记录红细胞层高度，再离心5min，如与第一次离心的高度一致，此时红细胞柱层所占的刻度数，即为PCV数值，用百分数表示。

图8—6 温氏红细胞压积测定管及冲液长针头

4.注意事项

（1）温氏管及充液用具必须干燥，以免溶血。

（2）离心时，离心机的转速必须达到3000r/min以上，并遵守所规定的时间。

（3）用一般离心机离心后，红细胞层呈斜面，读取时应取斜面1/2处所对应的刻度数。血浆与红细胞层之间的灰白层是白细胞与血小板组成，不应计算在内。

5.正常参考值    各种动物PCV正常值在30％～40％之间。