实验九  血常规检验（二）

（白细胞分类计数方法）

 

目 的 和 要 求

 

掌握血液涂片的制作方法、染色技术、白细胞分类计数方法，要求能制出合格的血片并能认识各类细胞。

内 容 和 方 法

 

白细胞分类计数：白细胞分类计数是将被检血推片染色，在显微镜下观察、计数并求出各种白细胞所占的百分率。

（一）原理  白细胞分类计数法是将血液制成分布均匀的薄膜涂片，用复合染料染色，根据各类白细胞着色特征予以分类计数，得出相对比值（百分率），以观察数量、形态和质量的变化，对疾病有辅助诊断意义。

（二）器材与试剂  载玻片、染色盆及支架、染色缸、洗瓶、显微镜及镜油、白细胞分类计数器、吸水纸等。

1.瑞氏（Wright）染液  瑞氏染粉0.1g，甲醇60.0ml。

将染色粉置于研钵中，加少量甲醇研磨，使其溶解，然后将已溶解的染液倒入洁净的棕色玻瓶，剩下未溶解的染料再加入少量甲醇研磨，如此继续操作，直至全部染料溶解并用完甲醇为止。在室温中保存7日后即可应用。新配制的染液偏碱性，放置后可呈酸性。保存时间越久，染色力越佳。

2.吉（Giemsa）氏染液  吉氏染粉0.5g，纯甘油33.0ml，纯甲醇33.0ml。先将染粉置于研钵中，加入少量甘油，充分研磨，然后加入其余量的甘油，水浴加温（60℃）1～2h，经常用玻璃棒搅拌，使染色粉溶解，最后加入甲醇混合，装棕色瓶中保存1周后过滤即成原液。临用时取此原液1ml，加PH6.8的缓冲液和新鲜蒸馏水10ml，即成应用液。

3.瑞—吉氏复合染色液  瑞氏染粉1.0g，吉氏染粉0.3g，中性甘油10ml，甲醇500ml。先将瑞氏染粉与吉氏染粉置于研钵中，加入少量甘油和甲醇，充分研磨，吸出上层染液置棕色瓶中，在加甲醇继续研磨，再吸出上液，如此连续数次，直至500ml甲醇用完。配好后每天早、晚各振摇3min，共5天，存放1周后可使用。

图9－1涂制血片的方法

                   图9—2  各种血膜的比较

4.缓冲液（PH6.4～6.8）磷酸氢二钠（Na₂HPO₄）0.2g，磷酸二氢钾（KH₂PO₄）0.3g。

                  图9—3 白细胞分类计数顺序

            1.四区计数法  2.三区计数法  3.中央曲折计数法

（三）涂片方法  取无油脂的洁净载玻片数张，选择边缘光滑的载片作为推片（推片一端的两角应磨去，也可用血细胞计数板的盖玻片作为推片），用左手的拇指夹持载片，右手持推片；先取被检血1小滴，放于载玻片的右端，将推片倾斜30°～40°角，使其一端与载片接触并放于血滴之前，向后拉动推片，使与血滴接触，待血液扩散形成一条线状之后，以均等的速度轻轻向前推动推片，则血液均匀地被涂于载片上而形成一薄膜。

良好的血片，血液应分布均匀，厚度要适当。对光观察时成霓虹色，血膜应位于玻片中央，两端留有空隙，以便注明动物性别、编号和日期，见图9-1及图9-2。

（四）染色方法

1.瑞氏染色法  是最常用的染色法之一。将自然干燥的血片用蜡笔于血膜之两端各划一道横线，以防染色液外溢。置血片于水平支架上，滴瑞士染液于血片上，并计其滴数，直至将血膜浸盖为止，待染1～2min后，滴加等量缓冲液或蒸馏水，轻轻吹动使之混匀，再染4～10min，用蒸馏水冲洗，吸干，油镜观察。

2.姬姆萨染色法  涂片用甲醇固定1～2min。将血片直立于装有姬姆萨氏应用液的染色缸中，染色 30～60min，取出用蒸馏水冲洗，干燥后镜检。

3.瑞氏与姬姆萨氏复合染色法  将血片置于染色架上，滴加染液3～5滴，使其迅速布满血膜，约1min后，滴加缓冲液5～10滴，轻轻摇动玻片使之充分混合，5～10min后用流水冲去染液，待干镜检。

（五）分类计数  先用低倍镜检视血片上白细胞的分布情况，一般是粒细胞、单核细胞及体积较大的细胞分布在血片的上、下缘及尾端，淋巴细胞多在血片的起始端。滴加显微镜油，转过镜头进行分类计数。

计数时，为避免重复和遗漏，可用四区、三区、或中央曲折计数法见图9-3，推移血片，记录每一区的各种白细胞数。每张血片最少计数100个白细胞，连续观察2～3张血片，求出各种白细胞的百分比。记录时，可用“白细胞分类计数器”，也可事先设计一个表格，用画“正”字的方法记录，以便于统计百分数。白细胞分类计数表见表9-1。

（六）各种白细胞的形态特征  各种白细胞的形态特征主要表现在细胞核及细胞浆的特有形状上，并应注意细胞的大小。各种白细胞的形态特征详见表9-2。

表9—1白细胞分类计数统计表

动物种类         门诊号          诊断          日期
计数区	Ⅰ	Ⅱ	Ⅲ	Ⅳ	合计(个)	百分比(%)
嗜碱性	1			1	2	1
嗜酸性 晚幼细胞	2	3	2	1	8	4
嗜中性杆状核	3	2	1	2	8	4
分叶核	37	31	22	30	110	55
淋巴细胞	15	17	19	15	66	33
单核细胞	2	1	2	1	6	3
合计	50	54	46	50	200	100

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

表9—2 各种白细胞的形态特征（瑞氏染色法）

白细胞分类		细胞核							细胞浆
		位置	形状	颜色	核染色质	细胞核膜	多少	颜色	透明带	颗粒
嗜中性幼稚型		偏心性	椭圆	红紫色	细致	不清楚	中等	蓝、粉红色	无	红或蓝、细致或粗糙
嗜中性杆状核		中心或偏心性	马蹄形蜡肠形	浅紫 蓝色	细致	存在	多	粉红色	无	嗜中、嗜酸或嗜碱
嗜中性分叶核	中心或偏心性		3～5叶者居多	深蓝紫色	粗糙	存在	多	淡粉红色	无	粉红色或紫红色
嗜酸性白细胞	中心或偏心性		2～3叶者居多	较淡紫蓝色	粗糙	存在	多	蓝、粉红色	无	深红，分布均匀，马的最大，其它动物次之
嗜碱性白细胞	中心性		叶状核不太清楚	较淡紫蓝色	粗糙	存在	多	浅粉红色	无	蓝黑色，分布不均匀，大多在细胞的边缘
淋巴细胞	偏心性		圆形或微凹入	深紫蓝色	大块、中等块致密	浓密	少	天蓝深蓝或淡红色	胞浆深染时存在	无或幼少数嗜天青蓝色颗粒
大单核细胞	偏心或中心性		豆形、山字形椭圆形	淡紫蓝色	细致网状、边缘不齐	存在	很多	灰蓝或云蓝色	无	很多，非常细小，淡紫色

 

（七）正常值 见表9-3

表9—3  各种动物白细胞分类正常平均值（％）

动物种类	嗜碱性白细胞	嗜酸性白细胞	嗜中性白细胞				淋巴细胞	单核细胞
			中幼细胞	晚幼细胞	杆状核	分叶核
牛 马 羊 猪 骆驼	0.5 0.5 0.5 0.5 0.5	4.0 4.5 4.5 2.5 8.0		0.5 0.5 1.0 1.0 1.0	3.0 4.0 3.0 5.5 6.5	33.0 54.0 33.0 32.0 47.0	57.0 34.0 55.5 55.0 35.0	2.0 2.5 3.5 3.5 2.0