实验二   蠕虫学粪便检查法（二）

    一．内容：

    １．沉淀法

    （１）自然沉淀法

（２）离心沉淀法

    ２．尼龙筛兜集卵法

    ３．虫卵计数法

    （１）斯陶尔氏法

（２）麦克马斯特氏法

4．幼虫检查法

    （１）漏斗幼虫分离法（贝尔曼氏法）

    （２）平皿法（法依德氏幼虫分离法）

    5．测微法

    二．目的：掌握粪便中虫卵检查和幼虫分离法，培养幼虫及虫卵计数法的操作技术，并学会测微器的使用及测微方法。

    三．参考资料：

    （一）．蠕虫虫卵检查法（之二）

    １．沉淀法  采用普通清水处理被检粪便，使虫卵沉淀集中，便于检查。本法适合检查各种虫卵，而比重较大的虫卵，如吸虫卵、棘头虫卵等尤宜采用此法。

①自然沉淀法

    取粪便5~10克，放入干净的烧杯内加水100毫升以上，搅匀成粪液，通过40、60目铜丝筛过滤。滤液收集于三角烧瓶或烧杯中，静置沉淀20~30分钟后，倾去上层液，保留沉渣，再加水混匀，再沉淀。如此反复直到上层液体透明为止，倒去上清液，吸取沉渣涂片镜检。此法特别适用于检查吸虫卵。

②离心沉淀法

    取粪便1~2克，放在干净的小烧怀内，约加10倍量的水，充分混匀成悬浮液，再用40、60目铜丝筛过滤至另一干净的离心管中，放入离心机内。也可用自然沉淀法处理过的滤液倒入离心管中，放在离心机内，以1500转/分的速度离心2~3分钟。此时，因虫卵比重大，经离心后沉于管底，然后倒去上清液，取沉渣镜检。

2．尼龙筛兜集卵法

取粪便5~10克，加水搅匀，先通过40、60目的铜丝筛过滤，滤下液再通过260目尼龙筛过滤，并在尼龙筛兜中连续加水冲洗，直到洗出液透明为止，而后挑取兜内粪渣做成抹片检查。此法适用于宽度大于６０微米的虫卵，如片形吸虫、姜片吸虫、同盘科吸虫、日本分体吸虫等的虫卵。通过以上处理，粗大粪渣被铜丝筛滤除，纤细的粪渣（直径小于40微米）和可溶性色素均被冲洗走而使虫卵集中。

    3．虫卵计数法：测定家畜每克粪便的虫卵数（ＥＰＧ）

    虫卵计数法是测定每克家畜粪便中的虫卵数，而以此推断家畜体内某种寄生虫的寄生数量，有时尚以使用驱虫药前后虫卵数量的对比，以检查驱虫效果。

    虫卵计数所得数字，受很多因素影响。因此只能对寄生虫的寄生量做一个大致的判断。影响虫卵计数精确性的因素，首先是虫卵在粪便内的分布不匀，因此测定少量粪便内的虫卵量以推算全部粪便中的虫卵总量就不会准确。此外寄生虫的年龄、宿主的免疫状态、粪便的浓稠度、雌虫的数量，驱虫药的服用等很多因素均影响着排出虫卵的数量和体内虫体数量的比例关系。虽然如此，虫卵计数仍被用作某种寄生虫感染强度的指标。

（１）斯陶尔氏法（Stell's metheod）

    在一小玻璃容器上（如小三角烧杯或大试管）的56毫升和60毫升处各做一标记，先取0.4％的氢氧化钠溶液注到容器56毫升处，再加入被检粪便完全破碎混匀，接着在混匀的情况下，以１毫升吸管取粪便液0.15毫升，滴下2~3张载玻片上，覆以盖玻片，在显微镜下秩序检查，统计其中虫卵总数（注意不可遗漏和重复）。因0.15毫升粪液中实际含原粪量是0.15×4/60＝0.01克。因此所得虫卵总数乘100即为每克粪便中的虫卵数。本法适用于大部分蠕虫卵的计数。

（２）麦克马斯特氏法（MeMastr's metlod）

本法是将虫卵浮集于一个计数室中。计数是由二片载玻片制成，常将其中一片切去一条，使之较另一片窄些。在较窄的玻片上刻以1平方厘米方格二个，而后选取厚度1.5毫米的玻片切成小条垫于二玻片间，以玻璃粘合剂粘合。这样两玻片间每个方格的容量为0.15立方厘米，即0.15毫升见下图：

方法：取粪便2克，放入小三角烧瓶或其它玻璃容器内，加入饱和盐水溶液58毫升，再加入小玻璃珠20个，充分振荡，使成均匀粪液，用吸管吸取粪汁注入麦克马斯特氏计数室的玻片间，将计算室放显微镜上，静置1~2分钟，计算1平方厘米方格内的虫卵数。求出两个刻度室中虫卵的平均数，由于一方格内的虫卵总数相当于0.15毫升中的虫卵数，而此粪汁又为60毫升含2克粪便所配成的，因此，将每一方格中的虫卵数乘以200，即为每克粪便中的虫卵数。

    4．幼虫检查法：

（１）漏斗幼虫分离法（贝尔曼氏法）

    取已培养好的粪便或新鲜粪便15—20克，放在漏斗内的金属筛上（或纱布上），不要捣碎。漏斗下接一短橡皮管，管下接一小试管，然后沿漏斗边缘缓慢地倒入40℃温水，浸没粪便的表面，此时还应注意水倒入后橡皮管内不应有气泡阻塞，如有气泡需排出，以免气泡阻碍幼虫下沉，静置1~3小时，幼虫遇热大部分游走于水中，并沉于管底部。拔取底部小试管，取沉渣，在显微镜下检查，可见有运动活泼的幼虫。本法适用于牛羊等反刍兽的肺线虫的检查，同时也应用于动物体解剖时检查某器管和组织中的幼虫，对饲料中或土壤中的线虫幼虫也可以分离到。

（２）平皿法（法依德氏幼虫分离法）

本法特别适用于球状的粪便，取粪球3—10个放于平皿或表面玻璃上，加少量40℃温水，10—15分钟后，取出粪球，将留下的液体在低倍镜下检查。

本法简单易行，效果亦佳，它主要用于绵羊、山羊和鹿的粪便检查，因这些动物粪便呈球形，较为干燥，不易破碎，幼虫常常集中在粪球表面，并且很难游出到温水中去。

    上述两种方法所得的幼虫，运动活泼，不易看清楚其结构，如欲致其死亡，做详细的观察，可在有幼虫的载玻片上，滴加卢戈氏碘液，则幼虫很快死亡，并染成棕黄色，有利于详细观察其内部结构。

    5．测微法：

    各种虫卵和幼虫，常有恒定的大小，测量虫卵或幼虫的大小，可作为确定某一虫卵或幼虫的依据。虫卵和幼虫的测量需用测微器，测微器由目镜测微尺和镜台测微尺组成。目镜测微尺是一个可放于目镜中隔环上的圆形玻片，其上刻有50—100刻度的小尺，使用时，将目镜的上端镜头旋开，将此测微尺放于镜头内隔环上，再将镜头旋好，此时通过此镜头即可在视野内见到一清晰的刻度尺，此刻度不具有绝对长度意义，而必须通过镜台测微尺计算。镜台测微尺是一载玻片，其中央刻有一标准刻度尺，一般是将１毫米均分成100小格，亦即每小格的绝对长度是10微米。使用时放于显微镜载物台上，调节显微镜使之与目镜测微尺重合；此时即可确定在固测算方法是：

    将目镜测微尺和镜台测微尺的零点重合，再寻找目镜测微尺和镜台测微尺的另一重合线。算出目镜测微尺的若干格相当于镜台测微尺的若干格，从而计算出目镜测微尺每格的长度。例如，在用10倍接目镜，40倍接物镜，镜简不抽出的情况下目镜测微尺的44格相法于镜台测微尺的15格（即150微米）即可算出目镜测微尺的每格长度为：150微米/44＝3.409微米。

    在测量具体虫卵时，可将镜台测微尺移去，只用目镜测微尺量度，如果量得某虫卵的长度为12格，测其具体长度应为：

     3.409×12＝40.908微米。

但应该注意，以上算得的目镜测微尺的换算长度，只适用于一定的显微镜，一定的目镜，一定的物镜条件，更换其中任一因素，其换算长度必须重新测算。

    四．作业：

    １．检查蠕虫卵的方法有哪几种？

２．根据虫卵计数法，把你计数的结果写出来。

3．试画出你所看到的幼虫形态图。

    4．用你所算出的目镜测微尺，测算几个虫卵的长度和宽度。