实验一    蠕虫学粪便检查法（一）

    一．内容：

    １．直接涂片法。

２．饱和盐水漂浮法。

３．粪便培养法。

    4．蠕虫卵的一般构造。

    5．虫卵与非虫卵的区别。

    二．目的：掌握粪便中蠕虫卵检查法的操作技术，并学习在显微镜下辨认吸虫卵、绦虫卵、线虫卵和棘头虫卵。

    三．参考资料：

    寄生蠕虫大部分寄生于家畜的消化道，它们的虫卵、幼虫和某些虫体或虫体断片通常和粪便一同排出。此外与消化道相连的器官（如肝、胰）中的寄生虫，其所产出的虫卵，也随粪便排出体外。呼吸道的寄生虫，其虫卵或幼虫随痰液排出，在痰液进入口腔后，多数又被咽下，因此也可以在粪便中查见其虫卵或幼虫，禽类泌尿生殖器宫内的寄生虫所排出的虫卵等，也同样出现在粪便中。因此粪便检查法是诊断这类蠕虫病的主要方法。

    检查时所采用的粪便材料一般尽可能取新排出的，这样可以使虫卵保持固有的状态。有时可直接由动物直肠采粪，更可减少混杂污染，取得更好的效果。

蠕虫学粪便检查法可分为：① 蠕虫虫体检查法，目的在于从粪便中发现整个虫体或节片，如莫尼茨绦虫，一般以肉眼直接检查；② 蠕虫虫卵检查法，目的在于从粪便中发现虫卵，如大多数的吸虫、绦虫和线虫；③ 蠕虫幼虫检查法，目的在于从粪便中发现幼虫，如牛、羊的网尾线虫等，随粪便排出的不是虫卵而是幼虫。

下面主要分述虫卵和幼虫检查法。

（一）   蠕虫虫卵检查法

1．直接涂片法：

    此法是最简便和常用的方法。但检查时被检的粪量少，检出率低。因此，本法只能作为辅助的方法，并且每次检查至少观察8~10张涂片，才能收到确切的效果。

    在洁净的载玻片上滴加1~2滴50%甘油生理盐水，再用牙签、镊子或火柴棍挑取少量粪便加入其中，与甘油生理盐水混匀，夹去较大的或过多的粪渣，最后使载玻片留有一层均匀的粪液，其浓度的要求是将此玻片放于报纸（或书）上，能通过粪液膜模糊地辨认其下的字迹为宜。在粪膜上覆以盖玻片。置显微镜下检查，检查时先在低倍镜下顺序查找，发现虫卵，再换高倍镜仔细观察。如无甘油生理盐水时，可以用常水代替，加甘油可使标本清晰，易于观察，并防止粪膜过快蒸发变干。但是检查原虫的滋养体，必须以生理盐水进行稀释，不应加甘油，否则会影响其运动而妨碍观察。

2．饱和盐水漂浮法（费勒鹏法）：

本法其基本原理为采用比重比虫卵高的漂浮液，使虫卵上浮于液体的表层，形成一层虫卵液膜，然后沾取此液膜进行镜检。此法简便有效，故在兽医工作中被广泛应用。但对于吸虫卵、后圆线虫卵及棘头虫卵，则由于它们的比重大于饱和盐水，故效果不理想。其操作步骤如下：

    先配制饱和食盐水溶液，配制时先将水烧开，然后加入食盐搅拌，直到不再溶解生成沉淀为止（1000毫升水中的约加食盐380克），溶液用双层纱布或棉花过滤溶液，待凉后即可使用（凉后的溶液中，如出现食盐结晶，则表明该溶液是饱和的，合乎要求，其比重为1.18）。

    取粪便5~10克，置于100~200毫升的烧杯中，先加少量饱和盐水，把粪便混匀，然后再加约为粪便的12倍量饱和盐水，并搅拌均匀，通过６０目铜筛或纱布滤入烧杯中，静置半小时，则虫卵上浮；用一直径5~10毫米的铂金耳或铁丝圈与液面平行接触以沾取表面液膜，抖落于载玻片上，加盖玻片检查，也可将此滤液直接倒入试管内，补加饱和盐水使试管充满，加上盖玻片（盖玻片与液面完全接触，不能留有气泡），直立半小时后，取下盖玻片，覆于载玻片上镜检，可收到同样效果。

为了提高漂浮法的检出率，可用硫酸钠饱和液（1750克硫代硫酸钠溶于1000毫升水中，其比重为1.4左右）；硫酸镁饱和液（920克硫酸镁溶于1000毫升水中，其比重为1.294）；糖饱和液等来代替饱和食盐液。但需注意，如溶液的比重过大，则粪便其它成份也随虫卵浮在液面上，影响检出率。有时比重加大同时出现粘稠度增加，使虫卵浮起的速度减慢。常见虫卵及漂浮液的比重如下表：

    注：（一）盐类饱和液必须保存在不低于13℃的情况下才能保持较高的比重。

    （二）操作中粪便不能互相污染，使用过的工具必须消毒或另换工具才能检查第二个粪样，粪便不能搞错，特别在大面积普查工作中，每次检查都要有详细的记录，粪球要求新鲜，防止暴晒、腐败而失效。

    （三）镜检时一定要详细观察，严格区别虫卵与非虫卵。

    3．粪便培养法

    圆形目所属线虫种类很多，其虫卵在形状和大小上又很难区别。有时为了区别这些线虫的种类，常将含有虫卵的粪便加以培养，待其中虫卵发育成为第三期幼虫时，再检查幼虫，根据第三期幼虫形态上的差异加以鉴别。

    最常用的方法是将待检的新鲜粪便塑成半球形，放在平皿内（如果羊粪、马粪因其本来就已成球形可直接放在平皿内），加少许水（如粪已很稀，就不必加水），放在25~30℃温箱中（夏天可在室温内）培养。根据具体情况，每天加少量水，使粪便保持一定的湿度，经7~10天的培养，卵即孵化成幼虫，并经二次脱皮，变为第三期幼虫，即具有感染力的幼虫，然后将培养的幼虫连同粪便一起用贝尔曼法分离出幼虫，进行镜检鉴定。

    应该指出：有些非常活跃的侵袭性幼虫常常离开粪便跑到潮湿的的平皿壁上，我们除了检查平皿内的粪便外，还须用水仔细冲洗平皿壁，将所得的液体与粪便一起倒入贝尔曼装置内，或单独用离心机进行分离后镜检。

    如果是为了研究某种蠕虫卵或幼虫的生物学特性，那就必须将待检粪便用蠕虫检查法加以处理，将同种的虫卵或幼虫搜集在一起，放于平皿内在25~30℃的温箱中进行培养，平皿内必须预先放好培养基。对于吸虫卵、绦虫卵、棘头虫卵和大多数线虫卵，可用水或生理盐水做培养基。最好的培养基是灭菌的粪便或粪汁，尤以后者为佳，因为用粪汁培养虫卵或幼虫时，可以直接将培养有虫卵的平皿放于显微镜下，观察虫卵或幼虫发育情况。粪便和粪汁的灭菌方法是在100℃的温度下煮沸２小时，接种虫卵或幼虫时，须先将粪汁用棉花过滤，这样在观察时就比较清晰，易于鉴别。

    四．各种蠕虫虫卵的一般构造：

    （一）线虫卵的一般特征：形状，大小各不相同，一般呈椭圆形或近似圆形；大多数虫卵的外形是对称的，卵壳多由四层膜组成。最外一层卵壳多数是平滑的；有的有结节；有的有小凹陷等。内含有多个细胞或一个已发育的幼虫；多为无色，透明、有些呈白色、褐色或黄褐色。

    （二）吸虫卵的一般特征：多呈卵圆形或椭圆形，大小不一，卵壳由数层膜组成，厚而坚实。大部分吸虫卵其一端有一小盖卵，内含有许多卵黄细胞及一个胚细胞，或含有一个已成形的毛蚴，常呈黄色、黄褐色和褐色。

    （三）绦虫卵的一般特征：圆叶目绦虫卵多呈三角形，立方形或近似圆形，大小不一，外层数多较厚，内有一个特殊的梨形器，梨形器内包含有一个六钩蚴，多为无色，少数为黄色或黄褐色。

    假叶目绦虫卵近似吸虫卵。

    （四）棘头虫卵的一般特征：多呈椭圆形或长椭圆形。卵壳很厚，外膜上常呈点窝状或蜂窝状构造。卵内中央有一个长椭圆形的胚胎，胚胎的一端有六个小钩，多呈棕黄色。

    五．虫卵与非虫卵的区别：

    虫卵：都有一定的卵壳结构，并且都有一定的形状。如圆形、椭圆形，三角形等，多数都是两侧对称的，内含有卵细胞或一个已发育的幼虫或毛蚴。

    非虫卵：在粪便中容易与虫卵相混淆的杂物有各种植物细胞、花粉颗粒、脂肪球汽泡、真菌孢子、螨类及其卵、纤毛虫、体细胞、结晶等等。但这些物质，由于种类不同，其形状、大小、颜色也各不相同。如各种植物细胞，有的呈螺旋形，有的呈双层环状物，也有呈铺石状。但都有明显的细胞壁，与虫卵结构显然不同。各种花粉颗粒往往多带有一定的颜色，易误认为蛔虫卵，但花粉颗粒没有卵壳的构造，表面呈网状或锯齿状，仔细观察，可以区别。脂肪球和气泡之类，亦很象虫卵。但脂肪球和汽泡往往大小不一，无色，且折光性很强，周围壁很厚，而内部是空虚的，不具有虫卵的一般结构。总之，粪渣中与虫卵易混淆的杂物较多，但只要掌握虫卵的构造和特征是可以辨认的。有时某物与虫卵分辨不清，也可用解剖针轻轻推动盖玻片下的东西滚动，这样往往可以把虫卵和其它物体区别开来。

    六．作业：

    1．在显微镜下怎样识别虫卵与非虫卵？

2．任选绘一虫卵形态图。