实验七 卵母细胞的采集

一、目的要求

卵母细胞的采集与获取是哺乳动物体外受精、细胞核移植和外源基因导入、动物克隆等胚胎工程技术的实验操作基础。通过本实验掌握超数排卵和卵巢上获取卵细胞的方法和检卵技术。

二、实验材料

小鼠，酒精棉球，器械盘，眼科剪，眼科镊子，眼科异物针，生理盐水，胚胎回收操作液，显微镜，擦镜纸，表面皿，卵母细胞吸管，检卵杯（或30mm细胞培养皿），吸管，1mL注射器，孕马血清促性腺素，人绒毛膜促性腺素，眼科，镊子，记号笔等。

三、内容和步骤

（一）小鼠卵母细胞采集及结构观察

1. 哺乳动物的卵子的生长发育与排卵过程：哺乳动物的卵子发生在卵巢的卵泡内进行。在卵母细胞成熟发育阶段，初级卵母细胞发生生发泡破裂(germinal vesicle breakdown, GVBD)现象，并完成第一次成熟分裂(减数分裂，以同源染色体分离为特征)，并排出第一极体。一般认为，GVBD的发生和第一极体的排出是卵母细胞核成熟的标志。之后，次级卵母细胞进行第二次成熟分裂(一般为有丝分裂,以染色单体分离为特征)，并停滞在第二次成熟分裂中期。在这期间，完成胞质的最后成熟。这时，卵泡发育成熟，将处于第二次成熟分裂中期的卵母细胞连同周围的卵丘细胞随着卵泡液排出。排出的卵母细胞经过输卵管漏斗部进入输卵管，运行到受精部位输卵管膨大部（壶腹部）。卵母细胞只有受精后才完全成熟，完成分裂后期和末期，接着形成一个已受精的合子并放出一个小的第二极体。

2. 小鼠卵母细胞采集：取已用激素提前超排处理好的小鼠，颈椎脱臼法处死，70％的酒精棉球消毒腹部。在下腹部中间剪开一个小口(图4-2A)，两只手或用镊子分别抓起切口的上下部皮肤，向头部和尾部牵拉直到充分暴露腹部(图4-2B)。切开腹膜，将内脏向上翻，即暴露两侧卵巢和输卵管(图4-2C)。用眼科镊子夹住子宫与输卵管联结处，用锋利的剪刀剪开输卵管系膜(图4-3A)，之后先剪断卵巢和输卵管之间的联系结构(图4-3B)，再剪断子宫与输卵管联结处，即得到输卵管部分，将输卵管转移到盛有PBS或生理盐水的培养皿中。

冲洗干净，以免血液或脂肪球混入液体妨碍检卵。由于小鼠输卵管非常细，不容易直接冲洗管腔。将培养皿置于实体显微镜载物台上，在低倍镜下找到输卵管膨大部（壶腹部）(图4-4)，用一支眼科异物针（或1ml注射器）固定输卵管，用另一支异物针（或1ml注射器）撕开壶腹部，一般情况下，卵丘-卵母细胞团会自动移出。

对输卵管膨大部判断不准时，可用异物针（或1ml注射器）纵向撕开整个输卵管。此时，卵母细胞周围包裹卵丘细胞，多个卵聚集成积云状。如果将卵母细胞团移到含透明质酸酶的液体中，卵母细胞就会分散成单个细胞。用较细的吸管吸检出卵母细胞到检卵杯中，用PBS洗3次，在实体显微镜下观察卵母细胞的形态结构。

3. 机械破碎法收集卵母细胞：将采过表面卵泡的卵巢从门部纵切为两半,去除黄体、髓质和多余的脂肪组织,置于无菌的培养皿中,用眼科剪在表面皿内剪碎卵巢皮质(直径<0.5mm)，之后,将碎组织置于另一培养皿中用冲卵液进行冲洗和静置。如此反复三次,得到4皿冲卵液,从中检出颗粒细胞-卵母细胞复合体(简称卵母细胞)。[采集卵母细胞所用的冲卵液为5%新生犊牛血清(NCS)的杜氏磷酸缓冲液(PBS)]。

4. 卵母细胞的观察：卵母细胞通常为圆球形。小鼠卵母细胞较小，直径为70-90μm左右，由透明带包围卵胞质构成。透明带外有放射冠，是由具有胞质突起的呈放射状排列的细胞(卵丘细胞)构成的。MII期卵母细胞成熟的标志是第一极体排出，小鼠卵母细胞的第一极体较大，容易辨认。

5. 卵母细胞的筛选：将收集的卵泡液分别置于无菌的捡卵杯（培养皿）内，静置后在体视显微镜下检卵。对检出的卵丘卵母细胞复合体(COCS)在实体显微镜下按A、B、C三级标准分级、记数并记录采集时间。

A级为胞质均匀并充满于透明带内且卵丘细胞层完整紧密、包裹3层以上;

B级为胞质均匀且卵丘细胞完整紧密,包裹1～3层;

C级为卵丘细胞包裹不完整,卵母细胞裸露,或胞质略有退化。

A、B级卵为体外培养可用卵。

四、实验报告

卵母细胞采集过程中如何尽量减少卵母细胞的损伤？